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熒光法因其具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品檢驗、化 學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物分析、冶金、生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等各個領(lǐng)域。簡單介紹了日立 F － 4500 型熒光分光光度計 的基本結(jié)構(gòu)，對其波長掃描的調(diào)試方法做了詳細介紹。

熒光分光光度計是一種用來掃描液相熒光標記 物所發(fā)出的熒光光譜的常用儀器。它不僅能提供發(fā) 射光譜、激發(fā)光譜，而且能提供熒光強度、量子產(chǎn)率、 熒光壽命以及熒光偏振等多種物理參數(shù)，可以從各 個角度反映分子的成鍵以及結(jié)構(gòu)情況。通過對這些 參數(shù)的測定，不但可以對樣品做定量分析，而且還 可以推斷出分子在不同環(huán)境下的構(gòu)象變化，從而闡 明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光光譜法有諸多 優(yōu)點，如靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便、 工作曲線線形范圍寬等，所以熒光分光光度計可以 廣泛應(yīng)用于食品檢驗、地理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物分析、 冶金、生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等各個領(lǐng)域［1 － 12］。日立 F － 4500 型熒光分光光度計的激發(fā)波長掃描范圍一 般是 200nm ～ 900nm，發(fā)射波長掃描范圍是 200nm ～ 900nm，可用于液體、固體樣品的光譜掃描。該儀器 采用的分析方法一般包括波長掃描、時間掃描、光度 值法、三維掃描。現(xiàn)就波長掃描方法的調(diào)試做一 介紹。 1 儀器的基本結(jié)構(gòu) ( 1) 激發(fā)光源: 高壓汞蒸氣燈或者氙弧燈，其中 氙弧燈能發(fā)射出強度較大的連續(xù)光譜，波長范圍在 300nm ～ 400nm ，且強度幾乎相等，所以常用氙弧燈 作激發(fā)光源。 ( 2) 激發(fā)單色器: 位于光源和樣品室之間，又叫 單色器，用于篩選出特定的激發(fā)光譜。 ( 3) 發(fā)射單色器: 位于樣品室和檢測器之間，也 叫第二單色器，常用光柵作為單色器。用于篩選出 特定的發(fā)射光譜。 ( 4) 樣品室: 通常情況下，液體樣品用石英池， 粉末或片狀樣品用固體樣品架。測量液體時，讓光 源與檢測器成直角; 測量固體時，讓光源與檢測器成 銳角。 ( 5) 檢測器: 一般用光電管或光電倍增管作檢測器。其作用是將光信號放大并轉(zhuǎn)為電信號。 2 開機前的準備 ( 1) 實驗室溫度應(yīng)保持在 15℃ ～ 30℃ 之間，濕 度應(yīng)保持在 45% ～ 70% 之間。 ( 2) 確認樣品室內(nèi)無樣品，安裝好所使用的樣 品池架，關(guān)上樣品室蓋。 ( 3) 準備好四面透明的石英比色皿。 3 調(diào)試方法 ( 1) 打開電腦主機電源。 ( 2) 打開電源開關(guān)( POWEＲ→ON) ，等待儀器風(fēng) 扇運轉(zhuǎn)正常。 ( 3) 間隔 10 秒后，按下氙燈的點燈按鈕( LAMＲ STAＲT) ，令黃燈亮起( 注意按鈕時間不能超過 20 秒) 。如果使用外接激發(fā)光源，不用操作該步驟。 ( 4) 當黃燈亮起不熄滅時，等待 5 ～ 10 分鐘，打 開主板電源( MAIN→ON) 。 ( 5) 點擊 FL solutions 圖標，打開儀器工作程序 窗口，等待儀器自檢。 儀器自檢完畢后，開機工作完成，然后進行分析 方法的編輯與樣品測試。 4 分析步驟 所謂波長的掃描，就是固定激發(fā)波長掃描熒光 強度隨發(fā)射波長的變化關(guān)系，或者是固定發(fā)射波長 掃描熒光強度隨激發(fā)波長的變化關(guān)系。其分析方法 ( Method) 包括 6 個選項，可以根據(jù)實驗要求具體選 擇。 點擊右側(cè)快捷欄的“Method”后，立即顯示了分 析方法( Analysis Method) 的 5 個重疊界面，分別為 General( 常規(guī)) ，Instrument( 儀器條件) ，Monitor ( 模 擬監(jiān) 視) ，Processing ( 處 理 方 法) ，Ｒeport ( 報 告 格式) 。 4． 1 “常規(guī) ( Genernal) ”選項的編輯 Measurement 選擇 Wavelength scan; Operator 輸 入操作者姓名; Instrument 自動給出，Sampling 中輸 入樣品名稱; Comments 輸入對樣品的簡要說明，也 可不輸入; Load 調(diào)用已經(jīng)存入的條件，一般不用; Save 保存現(xiàn)在的條件或 Save As 將現(xiàn)在的條件另 存為。 4． 2 “儀器條件( Instrument) ”選項的編輯 Scan mode( 掃描方式) 有兩種: Emission( 發(fā)射) 和 Excitation ( 激 發(fā)) ，Data mode ( 數(shù) 據(jù) 方 式) 選 擇 Fluorescence( 熒光采集) 。EX WL 輸入激發(fā)波長，EM Start WL 輸入發(fā)射光譜掃描的開始波長，EM End WL 輸入發(fā)射光譜掃描的結(jié)束波長，EM WL 輸 入發(fā)射波長，EX Start WL 輸入激發(fā)光譜掃描 的開始波長，EX End WL 輸入激發(fā)光譜掃描的結(jié)束 波長，Scan speed 選擇掃描速度，一般選擇 240，Delay 選 0，EX 和 EM 分別為激發(fā)單元和發(fā)射單元的狹 縫，一般情況下選 5． 0 即可。PMT Voltage 為光電管 電壓選擇，有 400V，700V，950V 三個值，一般選擇 700V。Ｒesponse 為響應(yīng)速度，一般選擇 2． 0s，速度 快則峰形分辨率高，但噪音大，速度慢則反之。選中 Shutter control，Ｒeplicates 設(shè)為 1。 如果是已知激發(fā)波長和發(fā)射波長的樣 品，按照上述方法輸入測試條件即可。實際掃描時， 若激發(fā)波長為 λex ，則掃描范圍一般為 λex + 20 ～ 2λex － 20 ，并且 2λex － 20 ≤ 900nm ; 若發(fā)射 波長為 λem ，則掃描范圍一般為 λem /2 + 20 ～ λem － 20，并且 λem － 20 ≤ 900nm 。 如果是未知條件的樣品可先選擇發(fā)射( Emission) 模式，在 EX WL 處輸入一個范圍在 200nm ～ 300nm 內(nèi)的激發(fā)波長，先預(yù)掃描發(fā)射光譜，記錄下峰 值波長 λem ; 然后選擇激發(fā)( Excitation) 模式，在 EM WL 處填入 λem 的值，掃描激發(fā)光譜，記錄下激發(fā)光 譜的峰值波長 λex ; 然后用該值 λex 再一次在發(fā)射模 式下掃描發(fā)射光譜，重復(fù)上面的過程，直到所得到的 兩個峰值波長不發(fā)生變化為止。這時得到的兩個峰 值波長即為激發(fā)波長和發(fā)射波長。 4． 3 “模擬監(jiān)視( Monitor) ”選項的編輯 Y Axis Max 的數(shù)值在樣品預(yù)掃描后儀器自動賦 值，Y Axis Min 需要根據(jù)具體情況手動賦值。Open data processing window after data acquisition( 測量后 打開數(shù)據(jù)處理窗口) 選中后測量結(jié)果可自動保存， 一般選中。Print report after data acquisition 選中后 數(shù)據(jù)采集后自動打印，一般不選。Overlay( 重疊光 譜圖) 選中后掃描時可將光譜圖重疊在監(jiān)視畫面 上，但重復(fù)掃描不可設(shè)定，一般選中。實際掃描時， 該選項一般不用編輯。 4． 4 “處理方法( Processing) ”選項的編輯 此界面主要是對已經(jīng)測定的圖譜根據(jù)用戶的要 求進行選擇處理。 CAT( 平均化) ，選中時儀器會對重復(fù)測定的圖 譜進行平均處理。 Processing( 處理方法的選擇) ，共有 4 種處理方 法: Savitsky － Golay Smooth ( Savitsky － Golay 平 滑) ，Mean Smooth ( 平均平滑) ，Median Smooth ( 中間平滑) ，Derivative ( 微分求導(dǎo)) 。Peak Finding ( 峰 檢 出) 共 有 3 項 內(nèi) 容，Integration ( 檢 出 方 法) 、 Threshold( 閾值) 和 Sensitivity( 靈敏度) 。其中 Integration 包 括 Ｒectangnlar ( 矩 形) 、Trapezoid ( 斜 方 形) 和 Ｒomberg ( 龍伯格) 三種檢出方法; Threshold 可決定信號峰的取舍，賦值范圍為 0． 001 ～ 1000，小 于賦值的峰可以顯示但不打印結(jié)果; Sensitivity 可改 變放大器的放大倍數(shù)。一般設(shè)置為 1。 4． 5 “報告格式( Ｒeport) ”選項的編輯 報告格 式 共 有 Output ( 輸 出) 、Orientation ( 方 位) 、Pintable items( 打印選項) 和 Printer Font( 打印 機字形) 。其中 Output 包括 3 種可選格式: Print Ｒeport 打印報告、Use Microsoft Excel 將數(shù)據(jù)變換為微 軟 Excel 格式、Use print generator sheet 利用變換器 ( 附選件) 打印圖表; 選中 Include data、Include method、Include graph、Include data listing、Include peak table、Peak WL /Peak data、Start WL /End WL、Valley WL /Valley data、Peak Area。 該選項需要注意的是，Date 輸入光譜橫坐標的 數(shù)據(jù)點間隔一般為 0． 2，Date start 和 Data end 的數(shù) 據(jù)一般要與 Instrument 中設(shè)置的 EM( Ex) Start WL 和 EM( EX) End WL 一致，否則激發(fā)光譜或發(fā)射光 譜掃描完后輸出的文本( txt) 文件的波長范圍與圖 譜文件( 擴展名為 FDS) 的波長不一致，而無法用其 他軟件對結(jié)果進行處理分析。這一點在操作時容易 被忽視，所以要注意。 4． 6 運行儀器測量樣品 將待測溶液倒入石英比色皿，用吸水紙將石英 比色皿外側(cè)的溶液拭去，打開樣品室蓋，將石英比 色皿放入樣品室中，蓋好蓋子。點擊右側(cè)的 Measure 按鈕，儀器開始測量。測量完成后，打開數(shù)據(jù)處理 窗口，點 File 菜單中的 Save as 保存圖譜文件，選擇 路徑并 設(shè) 置 文 件 名 后 保 存 圖 譜 文 件 ( 擴 展 名 為 FDS) ，用同樣的方法保存一個與圖譜文件相同文件 名的文本( 擴展名為 txt) 文件，將設(shè)置的參數(shù)保存 下來。 4． 7 關(guān)機順序 將石英比色皿從樣品室中拿出并清洗干凈。退 出所有程序，關(guān)閉電腦。關(guān)閉光度計主開關(guān)( MAIN →OFF) 。當電源開關(guān)關(guān)閉后 5 秒鐘，再次接通 10 分鐘，讓風(fēng)扇工作，使燈室散熱，后關(guān)閉電源開 關(guān)( POWEＲ→OFF) 。 5 結(jié)語 熒光分光光度計屬于大型精密儀器，價格昂貴， 故障較難維修并且費用較高。所以，應(yīng)嚴格按照正 確的順序操作，并定期進行維護和保養(yǎng)，否則將影 響激發(fā)光源的使用壽命，進而影響到整臺儀器的使 用壽命。目前熒光分光光度計的應(yīng)用范圍越來越 廣，所以應(yīng)操作熟練熒光分光光度計，以提高其利 用率。