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分光光度計應用于高中生命科學實驗, 可以實現(xiàn)從定性到定量實驗的轉變。 應用分光光度計實驗的方法一般為比色法 和分光光度法。 本文以蛋白質含量測定為例介紹比色法, 同時介紹了維生素 C和葡萄糖含量的比色法測定;以葉綠體色素的測定 介紹了分光光度法。 

分光光度計是一種常規(guī)的化學分析儀器 , 在高中 生命科學實驗中應用分光光度計 , 可以使現(xiàn)有的部分 實現(xiàn)從定性實驗向定量實驗的轉變 ,提升實驗的 度和內(nèi)涵 ,拓寬實驗技術在學生課外探究中的應用范 圍 。

1 比色法 許多物質本身具有一定的顏色 ,但有些物質本身 無顏色 ,如果加入適當?shù)娘@色劑就會生成有色物質 。 這些物質的共同特點是 ,顯色的深淺與物質濃度成正 比 ,即物質在溶液中濃度越大 , 顯示的顏色越深 。因 此 ,常利用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液 的濃度 ,這種方法叫做比色分析法 。在現(xiàn)有高中生 命科學實驗中 , 常用顯色法鑒別營養(yǎng)物質的存在 。應 用比色法可以對這些營養(yǎng)物質進行定量分析 ,并可以 將實驗拓展到測定核酸 (DNA、RNA)、膽固醇 、血 糖 、血清中尿素氮的含量 ,以及酶活性等 。

1.1 雙縮脲法測定蛋白質含量 蛋白質含有肽鍵 ,能 發(fā)生雙縮脲反應 ,形成紫紅色絡合物 ,顏色深淺與蛋白 質濃度成正比 , 可以用比色分析法來定量測定蛋白質 的含量 [ 1] ,如測定大豆蛋白質的含量 。實驗方法 : (1)稱取標準 蛋白質 (如結晶 牛血清 白蛋 白 ) 50mg,溶解于蒸餾水 ,并定容至 10mL, 配制成 5mg/mL 濃度的標準蛋白質溶液 。 (2)取大豆 5粒 ,稱量結果為 2.48g,浸泡 , 制成勻 漿 ,定容至 250mL,待測 。 (3)取 7支試管并依次編號 , 按照下表在 0 ～ 5號 試管中加入不同量的標準蛋白質溶液和蒸餾水 (制作 標準曲線 ),在 6號試管加入待測大豆溶液 ,并依次向 各試管中加入試劑回歸公式 “y=0.0526x+0.0042”即為該標準曲線 的方程 (與解析幾何中直線方程類似 ),其中 x為蛋白 質含量 , y為吸光度 。 R平方值表示趨勢線的可靠度 , 當 R平方值等于或近似于 1時 , 趨勢線可靠 。如果 R平方值較小 ,說明數(shù)據(jù)點偏離趨勢線的比較多 ,需要 進一步分析是不是誤差允許的范圍 [ 2] ,超出誤差范圍 的要分析原因并排除之 。 (6)將 6號試管測得的吸光度與標準曲線進行比 較 ,查出對應的蛋白質含量 。或者根據(jù)公式也可以求 出蛋白質含量 ,將 y0 =0.159代入 ,得 X0 =2.94。即大 豆溶液中蛋白質濃度為 2.94mg/mL, 樣品總蛋白質含 量為 0.735g,約 30%。 1.2 高錳酸鉀氧化還原法測定維生素 C的含量 維 生素 C是強還原劑 ,可以將紫色高錳酸鉀還原為無色 , 因此 ,高錳酸鉀可以被利用來查明食物中維生素 C的 存在 。利用分光光度計測定反應后的溶液的吸光度 , 吸光度與溶液內(nèi)剩余高錳酸鉀的濃度成比例 , 由此可 以間接測出維生素 C的含量 ,如測定橙子的維生素 C 含量 。實驗方法 : (1)試劑配制 分別配制 500μg/mL標準維生素 C溶液 (用維生素 C藥片配制 )、200μg/mLKMnO4 。 (2)取 50g左右的橙子果肉 ,準確稱量 ,記錄結果 , 制成勻漿 ,定容至 50mL,待測 。 (3)取 7支試管并依次編號 , 按照下表在 0 ～ 5號 試管中加入標準維生素 C溶液和蒸餾水 , 制成需要的 濃度梯度 (制作標準曲線 )。在 6號試管加入待測樣品 溶液 。

(4)從每只試管中取溶液 0.3mL,加入 200μg/mL KMnO4 3.7mL。以 0號試管為空白對照 , 分光光度計 于 565nm波長處調零 , 測定各支試管內(nèi)樣品在 565nm 的吸光度 (A565),重復測 3次 ,記錄并計算平均值 。

(5)利用 Excel繪制標準曲線 ,查出待測樣品溶液 的濃度 ,再換算出待測的維 C含量 。

1.3 鄰甲苯胺法測定葡萄糖的含量 葡萄糖在熱的 醋酸溶液中脫水后與鄰甲苯胺縮合 ,生成青色的產(chǎn)物 , 產(chǎn)物的量與葡萄糖的含量成正比 , 可以用比色法來測 定葡萄糖的含量 ,如測定蘋果的葡萄糖含量 。實驗方 法 : (1)試劑配制 先配制 10mg/mL標準葡萄糖原液 (以飽和苯甲酸溶液溶解 ),取 10mL容量瓶 5只 ,分別 編號 1、2、3、4、5,依次加入標準葡萄糖溶液 0.5mL、1. 0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL,再以苯甲酸鈉溶液定容至 10mL,混勻 。 1 ～ 5號容量瓶中葡萄糖濃度依次相當于 每 100mL中 含 葡萄 糖 50mg、 100mg、 200mg、 300mg、 400mg。 (2)準確稱量 ,取 10g左右蘋果果肉 ,制成勻漿 ,定 容至 100mL,待測 。 (3)按照下表實驗 ,重復測試 3次 ,繪制標準曲線 , 換算出待測樣品的葡萄糖含量 。

2 分光光度法 各種物質的分子結構不同 ,吸收光譜也各不相同 , 可以利用物質的特征吸收峰 ,對該物質進行定量分析 , 而不必將它從混合物中分離 。如果混合液中的不同組 分的光譜吸收峰有明顯的差異 ,吸收曲線彼此又有些 重疊 ,可以分別測定混合液在不同組分各自的吸收峰 的吸光度 ,再通過公式計算出各自的含量,葉綠體色 素的定量測定即是如此 。 葉綠素 a、b和類胡蘿卜素在 96%乙醇中大吸收 峰的波長分別為 665 nm、649 nm和 470 nm。由文獻  得知 ,葉綠體色素在此三個特定波長下的吸光度 (分別 表示為 A664 、A649 、A470 )與葉綠素 a、b和類胡蘿卜素的 濃度 (分別表示為 CA、CB、Cc,單位為 mg/L)之間有如 下關系 :CA =13.9665 -6.88A649;CB =24.96A649 -7. 32A665 ;Cc =(1000A470 -2.05CA -114.8CB)/245。根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠體色素的 含量 :葉綠體色素的含量 (mg/g)=(葉綠素的濃度 × 提取液體積 )/樣品鮮重 (或干重 )。 實驗方法 :取菠菜 (或其他植物 )葉片 0.2g,共 3 份 ,分別放入研缽中 ,加入少量石英砂和碳酸鈣以及 96%乙醇 5mL后研磨成勻漿 , 倒入離心管中 , 用 5mL 96%乙醇分兩次沖洗研缽 、研棒 , 3000r/min離心 5min。 將上清夜倒入 25mL棕色容量瓶中 ,用 96%乙醇定容 。 以 96%乙醇為空白 ,在波長 665 nm、649 nm和 470 nm 下測定吸光度 , 分別用 A665 、A649 、A470表示 。 實驗結果 見下表 (見下頁末 )。 其中 , x表示平均值 , a表示葉綠素 a, b表示葉綠 素 b, c表示類胡蘿卜素 。吸光度可以在分光光度計上 直接讀出 , 色素濃度 、組織中各色素含量通過計算獲 得 。 以上 4個定量實驗 ,既可以作為必修實驗的拓展 , 又可為學生設計探究課題提供思路 ,比如學生可以利 用分光光度計研究 “市售蛋白粉中蛋白質的含量是否 合格 ”、“探索蔬菜中維生素 C破壞量小的烹調方 式 ”、“市售果汁等飲料中維生素 C含量是否合格 ”、“不良環(huán)境對植物葉綠體色素含量的影響 ”等課題 ,提 高探究興趣 ,增強探究能力 。